分光光度法与比色法

分光光度法

在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。 上述的紫外光区与可见光区是常用的。但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。

比色法colorimetry
以可见光作光源，比较溶液颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法。
以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。比色法作为一种定量分析的方法，开始于19世纪30～40年代。比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。
常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律(A＝εbc)为基础。常用的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。
光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能 得到一定波长范围的复合光 ， 而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。20 世纪30～60年代，是比色法发展的旺盛时期，此后就逐渐为分光光度法所代替。

配制色度标准溶液和绘制色度标准曲线：
原理：用氯铂酸钾与氯化钴配成标准色列，（由于氯铂酸钾太贵，这里用重铬酸钾和氯化钴替代）与珠江水样进行比色。（比色时借助数据采集器、色度传感器和计算机进行精确比色）每升水含有1mg铂（铬）和0.5mg钴时所具有的颜色，称为1色度，作为标准色度单位。

第一，配制500度的色度标准溶液：称取0.0874g重铬酸钾和2.000g硫酸钴（CoSO4•7H2O），放入烧杯中，再加少量纯水和1.00ml浓度为1.00mol/L的硫酸，并用玻璃棒搅拌。完全溶解后，将溶液转移到1000ml电热容量瓶，并洗涤烧杯三次，将洗涤液移入容量瓶中。然后加纯水稀释至1000ml并定容。

第二，配制一系列的标准色度溶液：用碱性滴定管向50ml比色管滴入0ml、0.50 ml、1.00 ml、1.50 ml、2.00 ml、2.50 ml、3.00 ml、3.50 ml、4.00 ml、4.50 ml、5.00 ml、5.50 ml、6.00 ml、6.50 ml及7.00 ml上一步骤中配好的标准溶液，接着加纯水稀释至刻度线，塞上玻璃塞摇匀并密封保存。此时各比色管中溶液的色度依次为0度、5度、10度、15度、20度、25度、30度、35度、40度、45度、50度、55度、60度、65度和70度。
第三，测标准色列溶液的透光率：用连接线连接好数据采集器、色度传感器和计算机。将各比色管中的标准溶液分别先后注入比色皿并用色度传感器测出透光透过率，通过数据采集器采集数据并输入计算机在屏幕上显示出来保存或记录数据。
溶液透过率（%）     100.020    99.363    98.777    97.915    97.153
溶液色度（单位：度） 0         5         10        15        20
溶液透光透过率（%）  96.723    96.015    95.346    94.775    94.007
溶液色度（单位：度） 25        30        35        40        45
溶液透透过率（%）    93.337    92.668    92.002    91.329    90.659
溶液色度（单位：度） 50        55        60        65        70

第四，绘制标准曲线：用《Origin 6.0》软件把色度数据绘成“透过率—色度”标准曲线，然后求出标准曲线的解析式。

标准曲线的解析式：X=749.47243 － 7.494Y (X是色度，Y是浊度)
注意事项：
 1、称取0.874g重铬酸钾时，由于电子天平只能精确到两位小数，因此要取近似值0.87g。
2、使用电子天平时应先放上一张滤纸（防止电子天平的托盘被腐蚀），称取时应将药品集中在滤纸中央，不要过于分散。
3、用数据采集器、色度传感器和计算机测标准色列的透光度时，在测每次测标准溶液的透光率的时候应先将装有纯水的比色皿放入色度传感器中用微调将透过率调至100%。